內(nèi)皮糖萼由糖胺聚糖組成，包括透明質(zhì)酸（HA）、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素和唾液酸，是一種位于內(nèi)皮細(xì)胞頂端表面的糖蛋白復(fù)合物。該層有助于血管壁的屏障特性，并參與機(jī)械感應(yīng)和剪切力到內(nèi)皮的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

剪切應(yīng)力是指血流與血管內(nèi)皮間摩擦力。高剪切應(yīng)力（HSS，12-15 dyn/cm²）已被證明可以維持內(nèi)皮糖萼的完整性并抵抗早期動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展。然而，低剪切應(yīng)力（LSS，<5 dyn/cm²）也被認(rèn)為通過減少內(nèi)皮糖萼的尺寸在早期動(dòng)脈粥樣硬化中起關(guān)鍵作用。

研究發(fā)現(xiàn)，LSS 通過透明質(zhì)酸酶2（HYAL2）途徑降解內(nèi)皮糖萼內(nèi)的 HA，并進(jìn)一步證明 LSS 誘導(dǎo)的糖萼損傷導(dǎo)致 eNOS-Ser633 去磷酸化并減少 NO 產(chǎn)生。然而，LSS如何激活HYAL2仍不清楚。Na⁺-H⁺交換劑(NHE1)催化細(xì)胞內(nèi)H⁺離子的排出以交換細(xì)胞外Na⁺離子，是可能的候選者之一，并且是一種普遍存在的膜蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞pH值。有研究發(fā)現(xiàn)，NHE1被激活以產(chǎn)生酸性細(xì)胞外微環(huán)境，導(dǎo)致HYAL2在人乳腺腫瘤細(xì)胞中激活。據(jù)報(bào)道，在內(nèi)皮細(xì)胞中，HSS可引發(fā)AMPK磷酸化并增加AMPK的活性，AMPK在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值中起重要作用。AMPK是否通過細(xì)胞外基質(zhì)的NHE1酸化參與LSS誘導(dǎo)的HYAL2活化仍有待確定。

因此，南京醫(yī)科大學(xué)南京第一醫(yī)院心內(nèi)科的專家學(xué)者進(jìn)行了研究，使用功能喪失方法和AMPKα、NHE1和HYAL2的激活或失活，旨在確定LSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮糖萼損傷和早期內(nèi)皮炎癥對(duì)LSS的影響和分子機(jī)制。文章為《AMP-activated protein kinase regulates glycocalyx impairment and macrophage recruitment in response to low shear stress.》

圖1 平行平板流動(dòng)室示意圖
實(shí)驗(yàn)中的LSS為2 dyn/cm²，HSS為15 dyn/cm²。

NHE1 介導(dǎo) LSS 誘導(dǎo)的糖萼損傷

LSS激活NHE1的機(jī)制是否涉及AMPK，以及NHE1在LSS誘導(dǎo)的糖萼損傷中的作用尚不清楚。實(shí)驗(yàn)首先在細(xì)胞經(jīng)受LSS 5、15、30和60min后檢查了NHE1蛋白及其磷酸化以及NHE1的活性。未經(jīng)LSS處理的細(xì)胞用作對(duì)照。

盡管表面NHE1蛋白表達(dá)沒有顯著變化，但在LSS暴露15min后，NHE1磷酸化水平顯著升高，在30min時(shí)達(dá)到最高水平。NHE1活性早在LSS處理后15min就增強(qiáng)并持續(xù)至少60min。

為了確認(rèn)NHE1活性對(duì)響應(yīng)LSS的糖萼損傷的影響，在LSS暴露之前，用編碼顯性陰性形式的酶 (AdDN-NHE1) 的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)HUVECs，或用靶向NHE1活性的cariporide（卡立泊來德）預(yù)處理。使用AdDN-NHE1抑制NHE1活性顯著降低了 LSS誘導(dǎo)的NHE1磷酸化和NHE1活性。除了AdDN-NHE1外，cariporide也可抑制NHE1活性。

接下來，使用AFM檢查內(nèi)皮糖萼厚度（GCT）。糖萼的最大厚度為628nm。LSS顯著稀釋了內(nèi)皮糖萼，然而，使用AdDN-NHE1可抑制NHE1活性，或cariporide保護(hù)糖萼免受LSS誘導(dǎo)的GCT降低。

AMPK調(diào)節(jié)NHE1依賴性糖萼損傷以響應(yīng)LSS

實(shí)驗(yàn)顯示了AMPKα在其激活位點(diǎn)Thr172磷酸化的下調(diào)，伴隨著AMPK活性的降低，這在LSS處理后15min就很明顯，并且持續(xù)了至少60min。相反，AMPKα蛋白表達(dá)無明顯變化。為了檢查AMPK的失活是否介導(dǎo)LSS誘導(dǎo)的NHE1活化和糖萼降解，在沒有或存在AMPK激活劑ampkinone的情況下，將HUVECs暴露于LSS30min。在接受30minLSS的細(xì)胞中，用ampkinone處理恢復(fù)了AMPKα-Thr172磷酸化水平以及被LSS下調(diào)的 AMPK 活性。Ampkinone處理還阻止了響應(yīng) LSS的NHE1磷酸化和NHE1活性的增加。

在平行實(shí)驗(yàn)中，在LSS暴露前30min用AdCA-AMPKα轉(zhuǎn)導(dǎo)HUVECs。組成型活性AMPKα不僅恢復(fù)了由LSS抑制的AMPK活性，而且減弱了LSS誘導(dǎo)的NHE1磷酸化和NHE1活化。然而，使用AdDN-NHE1抑制NHE1活性既不會(huì)減弱AMPKα-Thr172去磷酸化，也不會(huì)逆轉(zhuǎn)LSS誘導(dǎo)的AMPK失活。

接下來研究了AMPK在LSS誘導(dǎo)的HUVECs糖萼損傷中的作用。HUVECs與AMPK激活劑ampkinone的孵育顯著減弱了LSS誘導(dǎo)的糖萼損傷。為了進(jìn)一步證實(shí)AMPK活性對(duì)LSS下內(nèi)皮糖萼損傷的影響，在HUVECs中表達(dá)了AdDN-AMPKα或AdCA-AMPKα。觀察到AdCA-AMPKα保護(hù)糖萼免受LSS誘導(dǎo)的損傷。然而，AdDN-AMPKα顯著逆轉(zhuǎn)了HSS誘導(dǎo)的糖萼保護(hù)。結(jié)果顯示cariporide、ampkinone、AdDN-NHE1和AdCA-AMPKα顯著阻止糖萼中HA表達(dá)降低和糖萼變薄以響應(yīng)LSS。這些結(jié)果表明LSS引起的AMPK失活介導(dǎo)了內(nèi)皮糖萼損傷。

之前的研究表明，HYAL2參與了響應(yīng)LSS的糖萼損傷。在該實(shí)驗(yàn)中，研究人員證實(shí)了LSS激活HYAL2降解內(nèi)皮糖萼。上述結(jié)果表明，LSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮糖萼降解起因于AMPK失活和NHE1活化。實(shí)驗(yàn)接下來研究了AMPK和NHE1對(duì)LSS刺激的HUVECs中HYAL2活化的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMPK和NHE1軸調(diào)控LSS誘導(dǎo)的HYAL2活化。最后，實(shí)驗(yàn)證明Ampkinone處理可防止LSS誘導(dǎo)的左頸總動(dòng)脈狹窄小鼠糖萼尺寸減少，并且保護(hù)內(nèi)皮糖萼延緩左頸總動(dòng)脈狹窄小鼠內(nèi)皮炎癥的發(fā)展。

總之，這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，暴露于LSS的內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK的去磷酸化可能有助于NHE1的激活。后者被認(rèn)為是一種離子通道蛋白，催化細(xì)胞內(nèi) H⁺ 離子和下調(diào)細(xì)胞外pH值。酸活性HYAL2降解內(nèi)皮糖萼中的HA，導(dǎo)致內(nèi)皮糖萼變薄。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)糖萼損傷導(dǎo)致粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)增加，以及巨噬細(xì)胞募集到左頸動(dòng)脈-PL小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞。因此，特定的糖萼保存，例如刺激AMPK，可能是一種預(yù)防早期內(nèi)皮炎癥和抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變形成的新策略。

參考文獻(xiàn)：Zhang J, Kong X, Wang Z, Gao X, Ge Z, Gu Y, Ye P, Chao Y, Zhu L, Li X, Chen S. AMP-activated protein kinase regulates glycocalyx impairment and macrophage recruitment in response to low shear stress. FASEB J. 2019 Jun;33(6):7202-7212. doi: 10.1096/fj.201801869RRR. Epub 2019 Mar 12. PMID: 30860864.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30860864/

圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻(xiàn)

Naturethink平行平板流動(dòng)腔
http://www.Naturethink.com/?product/64.html

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