肺癌是全球第二大常見癌癥，也是全球男性和女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因。非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 是最常見的肺癌類型，占所有病例的 80% 以上。在晚期NSCLC患者中，超過70% 的患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，其中80%發(fā)生在脊柱。

當(dāng)發(fā)生脊柱轉(zhuǎn)移時(shí)，常導(dǎo)致骨質(zhì)破壞、病理性骨折、嚴(yán)重的骨痛和神經(jīng)功能缺損。雖然化療、放療、手術(shù)切除等外科手術(shù)和綜合治療可以降低 NSCLC 脊柱轉(zhuǎn)移的發(fā)病率，但這些治療往往不能顯著提高總生存率。因此，迫切需要研究 NSCLC 衍生的脊柱轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并制定預(yù)防或早期治療NSCLC脊柱轉(zhuǎn)移的策略。

腫瘤轉(zhuǎn)移涉及一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程：腫瘤細(xì)胞從實(shí)體瘤中脫落；脫落細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）；與其他腫瘤細(xì)胞、血小板或其他細(xì)胞聚集形成CTC簇；到達(dá)遠(yuǎn)處器官并穿透局部血管；以及原位定植和周圍組織的相關(guān)破壞。這些過程依賴于幾種腫瘤調(diào)節(jié)因子，包括趨化因子、細(xì)胞因子和粘附分子，它們介導(dǎo)血管生成、腫瘤細(xì)胞存活和侵襲。

脊椎骨的紅骨髓具有特殊的血竇結(jié)構(gòu)，其中含有多種細(xì)胞因子、酶和激素，尤其是趨化因子。趨化因子是一個(gè)與結(jié)構(gòu)相關(guān)的小的分泌細(xì)胞因子家族，在炎癥和免疫中起著至關(guān)重要的作用。近年來，趨化因子已被證明參與調(diào)節(jié)各種腫瘤進(jìn)展過程，如白細(xì)胞招募、腫瘤細(xì)胞遷移和增殖。

在這些趨化因子中，C-X3-C 基序趨化因子配體 1 (CX3CL1) 被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中必不可少的調(diào)節(jié)因子。有趣的是，CX3CL1在脊椎骨的紅骨髓中比在肢骨中更豐富，這可能是脊柱轉(zhuǎn)移瘤的原因。盡管 CX3CL1 可能在脊柱腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用，但 CX3CL1 對 NSCLC 脊柱轉(zhuǎn)移的幾個(gè)方面的影響，特別是對 CTC 外滲到脊椎松質(zhì)骨的影響，這是腫瘤脊柱轉(zhuǎn)移的第一步和關(guān)鍵步驟，目前仍然尚不清楚。

以此為基點(diǎn)，上海復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院骨科、胸外科以及美國密西西比州的JMS 燒傷和重建中心的多位研究學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究，在 Theranostics 上發(fā)表了題為《Vertebral-specific activation of the CX3CL1/ICAM-1 signaling network mediates non-small-cell lung cancer spinal metastasis by engaging tumor cell-vertebral bone marrow endothelial cell interactions》的研究論文。

因此，實(shí)驗(yàn)假設(shè)脊柱中CX3CL1表達(dá)的增加促進(jìn)了循環(huán)NSCLC細(xì)胞的粘附和跨內(nèi)皮遷移，并引發(fā)了NSCLC脊柱轉(zhuǎn)移。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，實(shí)驗(yàn)檢測了脊椎松質(zhì)骨和脊椎骨髓內(nèi)皮細(xì)胞 (VBMECs) 中 CX3CL1 的含量，確定CX3CL1 是否影響循環(huán) NSCLC 細(xì)胞的生物學(xué)行為，如粘附、跨內(nèi)皮遷移和侵襲，并探討了其潛在機(jī)制。

最后，實(shí)驗(yàn)研究了阻斷 CX3CL1 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)是否可以限制轉(zhuǎn)移并延長體內(nèi)心內(nèi)模型的存活期。

本研究的結(jié)果證明，CX3CL1促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞向脊椎松質(zhì)骨的循環(huán)外滲，并突出了新的信號通路，為進(jìn)一步研究NSCLC脊柱轉(zhuǎn)移的預(yù)防或早期治療策略提供了依據(jù)。

細(xì)胞粘附試驗(yàn)

采用平行平板流動室灌注系統(tǒng)模擬脊椎血竇血流。在中間腔室底部植入單層VBMECs作為平行平板流動腔室的固定相，以2',7'-bis-(2-carboxyethyl)5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester 標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞為流動相，密度為5 × 105/mL，無血清培養(yǎng)基。加入濃度為300 × 109 pl/L的血小板(pl)。在通道中心以1000 s-1的壁切變速率灌注細(xì)胞2 min(用注射泵以0.3 mL/min的流速將血液模擬物推入平行平板流室)。細(xì)胞流經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞固定相后，將非粘附的腫瘤細(xì)胞洗去，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)貼壁熒光腫瘤細(xì)胞數(shù)量。

細(xì)胞共培養(yǎng)

Transwell上腔室預(yù)涂有Matrigel。在血清過夜后，將對照A549、shCX3CR1-A549、對照H1975或shCX3CR1-H1975細(xì)胞以20,000個(gè)細(xì)胞的密度接種到含有100 µL 條件培養(yǎng)液的上腔室，培養(yǎng)基為對照或敲除CX3CL1(CX3CL1-KD)的VBMECs，用10%的胎牛血清，培養(yǎng)6天。此外，由指定的A549或H1975細(xì)胞和VBMEC培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)系統(tǒng)用AKT抑制劑MK-2206 2HCI (3 µM) 或PI3K抑制劑LY294002 (20 µM) 處理。在顯微鏡下測定細(xì)胞數(shù)。每孔中隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域，通過計(jì)數(shù)染色細(xì)胞數(shù)量來定量分析。

VBMECs 通過 CX3CL1 信號介導(dǎo)的 PI3K/AKT 通路激活增強(qiáng) NSCLC 細(xì)胞的侵襲

作為一種趨化因子，CX3CL1 已被證明可以促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲。為了研究 CX3CL1 在 VBMECs 中的表達(dá)增加是否通過加速細(xì)胞侵襲來促進(jìn) NSCLC 脊柱轉(zhuǎn)移，實(shí)驗(yàn)將A549細(xì)胞與VBMECs條件培養(yǎng)液一起培養(yǎng)，使用Transwell實(shí)驗(yàn)來量化NSCLC細(xì)胞的侵襲。

與對照相比，在條件培養(yǎng)液中生長的 A549 細(xì)胞的侵襲能力提高了約 3 倍；與對照組相比，腫瘤細(xì)胞的侵襲性增加了3 倍（圖1 B-C）。VBMECs 中 CX3CL1 的基因消融最小化了VBMECs導(dǎo)致的A549細(xì)胞侵襲增加（圖1 A-C，P< 0.01)。

此外，在A549細(xì)胞中沉默CX3CR1 (CX3CL1的唯一受體)，顯著降低了VBMEC誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲(P < 0.01)，表明CX3CL1/CX3CR1功能性地介導(dǎo)了VBMEC對NSCLC細(xì)胞侵襲的影響。這些結(jié)果表明 VBMECs 通過 CX3CL1 依賴性信號通路促進(jìn) NSCLC 細(xì)胞侵襲。

為了研究CX3CL1介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞侵襲是否通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 發(fā)生，實(shí)驗(yàn)檢測了在VBMECs條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后A549細(xì)胞中EMT標(biāo)記物的表達(dá)水平。然后還分析了幾種基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs) 的表達(dá)，已知這些蛋白酶參與基質(zhì)降解，而基質(zhì)降解是細(xì)胞侵襲的重要組成部分。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VBMECs 通過 CX3CL1 依賴性促進(jìn) EMT 和 MMP 介導(dǎo)的基質(zhì)降解來上調(diào) NSCLC 細(xì)胞侵襲（圖 1 D）。

此外，實(shí)驗(yàn)檢測了 PI3K 和 AKT 的表達(dá)水平。與VBMECs條件培養(yǎng)液共培養(yǎng)有效促進(jìn)A549細(xì)胞PI3K和AKT磷酸化，PI3K和AKT總表達(dá)水平無明顯變化，表明PI3K和AKT磷酸化參與VBMEC介導(dǎo)的促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的侵襲能力（圖1 E)。

為了證實(shí)PI3K/AKT通路在VBMECs調(diào)控的NSCLC細(xì)胞侵襲中的作用，實(shí)驗(yàn)使用了PI3K抑制劑LY294002和AKT抑制劑MK-2206 2HCI。

有趣的是，與條件培養(yǎng)液處理的對照組相比，LY294002 和 MK-2206 2HCI 處理的 A549 細(xì)胞顯著抑制了侵襲能力，逆轉(zhuǎn)了 VBMECs 引起的變化（圖1 F-G）。蛋白質(zhì)印跡分析表明，LY294002 或 MK-2206 2HCI 恢復(fù)了條件培養(yǎng)液處理的 A549 細(xì)胞中降低的 鈣黏蛋白表達(dá)，而 LY294002 或 MK-2206 2HCI 處理可降低Vimentin、MMP-2和MMP-9蛋白的上調(diào)（圖1 H）。

總體而言，這些數(shù)據(jù)表明，VBMECs 通過以 CX3CL1/CX3CR1 依賴性方式激活 PI3K/AKT 通路，賦予 NSCLC 細(xì)胞侵襲優(yōu)勢。

圖1 VBMECs 通過 CX3CL1 信號介導(dǎo)的 PI3K/AKT 通路激活增強(qiáng)了 NSCLC 細(xì)胞的侵襲。

CX3CL1 通過ICAM-1 依賴性激活Src/GEF-H1 通路增加 VBMECs 的通透性，從而增強(qiáng) NSCLC 細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移

跨內(nèi)皮遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，因此，實(shí)驗(yàn)研究了 CX3CL1 對 NSCLC 細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的影響（圖2 A）。如圖2 C和圖3 B，NSCLC細(xì)胞通過CX3CL1- KD VBMEC屏障的細(xì)胞數(shù)量明顯低于通過對照組VBMEC屏障的細(xì)胞數(shù)量，因此NSCLC細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移需要CX3CL1。

此外，VBMECs 中的 ICAM-1 過表達(dá)挽救了 CX3CL1-KD 抑制 NSCLC 細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的有效性，表明 CX3CL1 介導(dǎo)的 NSCLC 細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移需要 ICAM-1 信號傳導(dǎo)（圖 2 B-C 和圖 3 A-B）。

為了研究 CX3CL1 / ICAM-1 介導(dǎo)的 NSCLC 細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的機(jī)制，使用 FITC 標(biāo)記的跨內(nèi)皮葡聚糖通量來檢測單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性。如圖2 D，CX3CL1基因切除顯著抑制葡聚糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，而ICAM-1的過表達(dá)顯著挽救了CX3CL1切除降低經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞葡聚糖轉(zhuǎn)運(yùn)的功效。

蛋白質(zhì)印跡分析表明，CX3CL1基因抑制顯著降低了VBMECs中Rho 相關(guān)激酶1 (ROCK1) 的表達(dá)，降低了Ras Homolog Family Member A (RhoA)和myosin light chain (MLC) 的磷酸化水平，而 ICAM-1 過表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了這一變化。（圖2 E 和圖3 C）。

考慮到經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞的葡聚糖轉(zhuǎn)運(yùn)直接反映了VBMEC的通透性，而ROCK1、RhoA和MLC是調(diào)控細(xì)胞骨架的關(guān)鍵分子，我們認(rèn)為CX3CL1可以通過以ICAM-1依賴性的方式有效上調(diào)VBMEC的通透性，從而導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移增加。

鑒于 CX3CL1 和 ICAM-1 并不直接調(diào)控 VBMECs 的通透性，應(yīng)該有其他信號通路負(fù)責(zé)改變 VBMEC 通透性。如在所示圖2的F-G和圖3 D、F，ICAM-1的基因切除顯著降低了Src的磷酸化和GEF-H1的表達(dá)，并降低了ROCK1、p-RhoA和p-MLC的水平。

此外，當(dāng)使用Src信號通路激動劑三苯氧胺時(shí)，ICAM-1沉默誘導(dǎo)的ROCK1、p-RhoA和p-MLC水平的降低被顯著逆轉(zhuǎn)（圖2 G和圖3 F）。此外，ICAM-1-KD可抑制葡聚糖轉(zhuǎn)運(yùn)，這種效果被三苯氧胺逆轉(zhuǎn)（圖2 H）。此外，ICAM-1可顯著降低腫瘤細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移，使用三苯氧胺也可以逆轉(zhuǎn)這種情況（圖2 I 和圖3 G）。

總的來說，CX3CL1 可以通過ICAM-1 依賴性激活Src/GEF-H1 通路，增加 VBMEC 的通透性，從而誘導(dǎo) NSCLC 細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移。

圖2 CX3CL1/ICAM-1通過Src/GEF-H1途徑增加VBMEC的通透性，從而增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移

圖3

綜上所述，該研究結(jié)果表明，脊椎骨中高表達(dá)的 CX3CL1 / ICAM-1 通過驅(qū)動循環(huán) NSCLC 細(xì)胞和 VBMECs 之間的脊柱特異性惡性循環(huán)來促進(jìn) NSCLC 脊柱轉(zhuǎn)移。

該循環(huán)基于 CX3CL1 / ICAM-1 介導(dǎo)的 NSCLC 細(xì)胞-VBMEC 的相互作用，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性和粘附性，改善VBMEC的通透性，并通過多種信號通路增加 NSCLC 細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移。該研究中描述的機(jī)制可能為預(yù)防NSCLC脊柱轉(zhuǎn)移提供潛在的新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：
Wang K, Jiang L, Hu A, Sun C, Zhou L, Huang Y, Chen Q, Dong J, Zhou X, Zhang F. Vertebral-specific activation of the CX3CL1/ICAM-1 signaling network mediates non-small-cell lung cancer spinal metastasis by engaging tumor cell-vertebral bone marrow endothelial cell interactions. Theranostics. 2021 Mar 4;11(10):4770-4789. doi: 10.7150/thno.54235. PMID: 33754027; PMCID: PMC7978319.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33754027/

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