血管供應受損和新生血管形成不足是骨修復和骨再生的主要臨床挑戰(zhàn)。機械刺激決定了骨愈合的方式。研究發(fā)現(xiàn)，機械線索直接調(diào)節(jié)骨再生過程中的新生血管形成，具體取決于應變幅度和時間。具體來說，早期負荷會破壞血管浸潤。

血管生成誘導因子61（CYR61，也稱為 CCN1）是一種基質(zhì)細胞生長因子，可促進內(nèi)皮細胞粘附以誘導血管生成，并與細胞表面和細胞外基質(zhì)成分結(jié)合。據(jù)報道，CYR61 在骨骼發(fā)育過程中調(diào)節(jié)軟骨形成和成骨作用，并且還與骨折修復有關(guān)。具體來說，CYR61 表達可以通過骨折修復過程中的機械刺激來改變，并且 CYR61 的單核苷酸多態(tài)性會增加骨折不愈合的風險。

基于此，美國賓夕法尼亞大學骨科系、生物工程系及伊利諾伊大學芝加哥分校生物工程系研究團隊假設(shè)外源性 CYR61 可以通過介導血管重建和促進血管生成-成骨串擾來促進骨再生，從而克服早期機械負荷的血管抑制效應，并在研究中繪制了骨修復過程中內(nèi)源性 CYR61 的分布，評估了重組 CYR61 遞送對不同動態(tài)負荷條件下早期愈傷組織形成和血管重建的影響。研究發(fā)現(xiàn)，CYR61 遞送在早期骨折修復期間促進了血管生成，但在機械條件下則不然。研究成果發(fā)表于 npj Regenerative Medicine 期刊題為“CYR61 delivery promotes angiogenesis during bone fracture repair”。

首先，為了了解外源性 CYR61 遞送如何影響骨折修復，檢查了小鼠股骨骨折模型中骨折后 14 天內(nèi)源性 CYR61 豐度及其上游調(diào)節(jié)因子 YAP 以及它們與血管和骨/軟骨祖細胞的空間關(guān)系，對 CYR61、YAP、內(nèi)粘蛋白（EMCN，標記內(nèi)皮細胞）和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體（OSX，標記骨祖細胞系細胞和肥厚軟骨細胞）的進行了染色，觀察到 CYR61 豐度在在骨折相鄰骨髓中最為突出，但在骨折間隙中沒有高表達。CYR61 和 YAP 染色在靠近 EMCN-陽性內(nèi)皮細胞的血管豐富基質(zhì)內(nèi)特別突出。這些發(fā)現(xiàn)表明，內(nèi)源性 CYR61 與血管化的細胞外基質(zhì)相關(guān)，而對細胞 YAP 保持陽性的軟骨內(nèi)骨痂組織顯示 CYR61 含量較少。CYR61 和 YAP 豐度之間的這種空間差異可能是時間動力學的結(jié)果，其中 CYR61 在 YAP 激活期間被釋放到基質(zhì)中，并在 YAP 活性下降后持續(xù)存在。

隨后，在體外評估了人骨髓基質(zhì)細胞（hMSCs）的分化和 3D 血管生成。在轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1 誘導的軟骨生成沉淀測定中檢測了外源性 CYR61 對軟骨基質(zhì)沉積的影響，并在成骨培養(yǎng)基分化試驗中檢測了成骨基因誘導（圖1 a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYR61 處理在 TGF-β1 缺失的情況下以劑量依賴性方式增加 hMSCs 軟骨分化小球的大小，但并不單獨誘導軟骨生成或糖胺聚糖（GAG）沉積（圖1 b）。TGF-β1 處理誘導軟骨形成和 GAG 沉積，但與 CYR61 聯(lián)合處理對軟骨形成、GAG 產(chǎn)生或顆粒大小沒有影響（圖1 b、c）。在成骨實驗中，成骨培養(yǎng)基顯著誘導成骨標志基因 RUNX2、SP7 和 ALP 的 mRNA 表達，以及 CYR61 的表達，然而，雖然外源性 CYR61 在成骨條件下顯著增加了 RUNX2 的表達，但并沒有改變 SP7 或 ALP 的表達，也沒有改變 CYR61 自身的表達（圖1 d）。

在 GFP 標記的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）和人骨髓基質(zhì)細胞（hMSCs）共培養(yǎng)的體外 3D 血管生成試驗中評估了外源性 CYR61 處理對內(nèi)皮細胞管形成的影響（圖1 e）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYR61 處理在 3 天后顯著增加了 GFP + 細胞面積密度，CYR61 增加的管狀網(wǎng)絡形成與第3天和第5天時管數(shù)量減少和管長度增加相吻合（圖1 g）。

這些數(shù)據(jù)表明，在這些體外條件下，外源性 CYR61 處理改變了 hMSCs 軟骨分化小球的生長，但不促進 TGF-β1 誘導的軟骨形成，并且僅輕度影響成骨基因表達。相比之下，外源性 CYR61 強烈刺激內(nèi)皮細胞管形成網(wǎng)絡。

接下來，為了確定 CYR61 遞送在不同動態(tài)負荷下對骨再生的影響，使用 GelMA/纖維蛋白支架將 CYR61 遞送到小鼠股骨截骨部位（圖2 a），發(fā)現(xiàn)骨折 14 天后在柔性固定時 CYR61 遞送顯著減少了骨痂體積，但骨體積沒有改變（圖2 b、c）。MOVAT 染色表明，與未處理組相比，剛性固定組使用 CYR61 處理后纖維組織的形成更明顯（圖2 d），由相對礦化骨量減少支持（圖2 e），兩組軟骨面積差異無統(tǒng)計學意義（圖2 e）。這表明，局部 CYR61 遞送在第 14 天時沒有增強骨折部位的骨或軟骨的形成。

圖1 CYR61 加速體外血管生成，但不能促進 hMSCs 的軟骨生成或成骨。

進一步地，繼續(xù)探討 CYR61 遞送是否會在骨折修復過程中促進新生血管形成，這取決于機械環(huán)境。使用 EMCN 標記血管、OSX 標記成骨細胞系細胞、F4/80 標記巨噬細胞、 SOX9 標記軟骨細胞，分析免疫熒光染色。與對照組相比，CYR61 在剛性固定下顯著增加血管形成，但在柔性固定下這種作用被消除。在柔性固定下，OSX+ 面積顯著減少，但 CYR61 遞送并未顯著改變 OSX+ 細胞的數(shù)量或分布，還提高了巨噬細胞的侵襲，但這被 CYR61 遞送所抑制。SOX9 染色未觀察到顯著差異，但在柔性固定下，骨折間隙中的細胞總數(shù)減少。這些數(shù)據(jù)表明，CYR61 遞送可以促進骨折修復過程中的血管生成，但這種影響可以通過骨折后立即開始動態(tài)機械負荷來消除。

圖2 CYR61 在骨折 14 天后未增強骨折部位骨痂或軟骨形成。

鑒于上述實驗觀察到早期機械負荷消除了 CYR61 治療的血管生成作用，因此，試圖探究 CYR61 的促血管生成能力與機械負荷開始時間之間的相互作用。研究人員使用 3D 血管網(wǎng)絡芯片，該芯片將 hMSCs、人成纖維細胞和內(nèi)皮祖細胞嵌入微生理學平臺上的纖維蛋白水凝膠中。該平臺加載動態(tài)機械負荷，在兩種不同的加載情況下每天以 10% 的壓縮幅度施加1小時的壓縮負荷（1 Hz，單向壓縮）：早期加載（從第 0 天開始，持續(xù) 7 天）和延遲加載（在第 4 天開始，然后加載 3 天）（圖3 a）。從第 0 天開始，將 CYR61 或 PBS 對照添加到細胞培養(yǎng)基中（圖3 b）。

在靜態(tài)和延遲壓縮條件下，CYR61 處理顯著增加了血管長度，并且無論機械負荷如何，血管網(wǎng)絡面積都增加了（圖3 b、d）。然而，血管長度和面積取決于負荷條件。CYR61 處理在靜態(tài)和延遲壓縮條件下顯著增加了血管連接數(shù)量（圖3 e）。為了評估血管網(wǎng)絡連接性，對血管端點的數(shù)量進行量化，發(fā)現(xiàn)早期壓縮負荷增加了血管端點數(shù)量，表明血管網(wǎng)絡連接受損。CYR61 處理挽救了這種情況，表明早期負荷破壞了網(wǎng)絡形成，而 CYR61 刺激阻止了這一影響，促進血管成熟（圖3 f）。

圖3 無論是否有體外機械負荷，CYR61 均促進血管成熟。

總之，該研究發(fā)現(xiàn)，CYR61 遞送在骨折修復過程中促進了血管生成，但這種作用被早期機械負荷所抵消。因此，雖然 CYR61 在體外和體內(nèi)都具有有效的血管生成能力，但在不利于功能性血管形成的機械條件下，CYR61 并沒有增強血管形成。

參考文獻：Lang A, Eastburn EA, Younesi M, Nijsure MP, Siciliano C, Pranatharthi Haran A, Panebianco CJ, Seidl E, Tang R, Alsberg E, Willett NJ, Gottardi R, Huh D, Boerckel JD. CYR61 delivery promotes angiogenesis during bone fracture repair. NPJ Regen Med. 2025 Apr 22;10(1):20. doi: 10.1038/s41536-025-00398-y. PMID: 40263309; PMCID: PMC12015299.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40263309/

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