骨關(guān)節(jié)炎（OA）作為一種常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，病理機(jī)制復(fù)雜，涉及軟骨降解、滑膜炎癥、軟骨下骨硬化等多個(gè)方面，嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量。但由于對其進(jìn)展機(jī)制缺乏了解，當(dāng)前治療手段僅能緩解癥狀或延緩進(jìn)展，晚期需依賴關(guān)節(jié)置換手術(shù)，因此闡明 OA 發(fā)病的潛在機(jī)制對探索創(chuàng)新治療方法至關(guān)重要。

關(guān)節(jié)軟骨作為與外力相關(guān)的生物力學(xué)部位，其發(fā)病與機(jī)械負(fù)荷密切相關(guān)，生理狀態(tài)下軟骨細(xì)胞會承受日?；顒?dòng)帶來的應(yīng)力、應(yīng)變等，而異常機(jī)械過載則可能導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)退化，進(jìn)而引發(fā) OA。其中，流體剪切應(yīng)力（FSS）是關(guān)鍵的生理和病理因素，較低的剪切應(yīng)力具有軟骨保護(hù)作用，較高的剪切應(yīng)力則會誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)基質(zhì)降解酶表達(dá)，導(dǎo)致 OA 樣病理特征。鑒于軟骨組織修復(fù)和再生能力有限，深入研究 FSS 誘導(dǎo) OA 發(fā)病的潛在機(jī)制具有重要意義。

近年來，表觀遺傳改變因其可介導(dǎo)多種病理反應(yīng)而受到廣泛關(guān)注，其中組蛋白的甲基化、磷酸化、乙酰化等修飾會調(diào)控參與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，例如 NSD3 組蛋白甲基化活性升高可驅(qū)動(dòng)肺鱗狀細(xì)胞癌惡性進(jìn)展，提示了相關(guān)治療策略的潛力。對于骨關(guān)節(jié)炎，已有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；福?/span>HDAC）表達(dá)異常，暗示調(diào)節(jié)特定 HDAC 活性可能成為治療 OA 的方向，另有研究證實(shí) EZH2 可通過促進(jìn) miR-138 啟動(dòng)子的組蛋白甲基化抑制其表達(dá)，進(jìn)而抑制 OA 進(jìn)展。然而，盡管多項(xiàng)研究提示表觀遺傳在 OA 發(fā)病中具有潛在作用，但其詳細(xì)調(diào)控機(jī)制、基于表觀遺傳的治療靶點(diǎn)，尤其是與機(jī)械力相關(guān)的 OA 發(fā)病中的表觀遺傳調(diào)控具體機(jī)制仍不明確。

因此，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔正畸科的研究團(tuán)隊(duì)通過體外FSS 模型和體內(nèi)單側(cè)前牙反合（UAC）小鼠模型，明確異常 FSS 對原代軟骨細(xì)胞的影響，闡明 H3K4me3 在異常 FSS 誘導(dǎo) OA 中的作用，同時(shí)探究表觀遺傳調(diào)控在機(jī)械相關(guān)軟骨發(fā)病中的作用，以及靶向表觀遺傳事件作為未來治療策略的可能性。研究成果發(fā)表在Journal of inflammation research期刊，題為“Aberrant Fluid Shear Stress Contributes to Articular Cartilage Pathogenesis via Epigenetic Regulation of ZBTB20 by H3K4me3 ”。

首先，研究人員對原代軟骨細(xì)胞施加 20 達(dá)因 / 平方厘米的流體FSS 并處理 2 小時(shí)，以探究異常高剪切應(yīng)力的影響。結(jié)果顯示，FSS 會顯著破壞細(xì)胞形態(tài)（表現(xiàn)為 F - 肌動(dòng)蛋白排列不規(guī)則）（圖 1A），且通過 EdU 染色發(fā)現(xiàn)，FSS 作用下的原代軟骨細(xì)胞增殖能力和活力均有所下降（圖 1B）。

然后，研究人員進(jìn)一步研究了 FSS 對軟骨相關(guān)標(biāo)志物、分解代謝反應(yīng)、炎癥相關(guān)因子及細(xì)胞外基質(zhì)降解的影響。結(jié)果顯示：FSS 處理后，軟骨相關(guān)標(biāo)志物 Sox9、Acan、Col2 的 mRNA 水平顯著下調(diào)，而肥大相關(guān)標(biāo)志物（如 Col10、Cox-2 、Adamts4 和 Adamts5 ）、多種基質(zhì)金屬蛋白酶（包括 Mmp3、Mmp9 和 Mmp13 ）及典型炎癥因子（TNF-α、IL-1β 和 IL-6 ）均顯著上調(diào)。蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，FSS 會抑制 COLII 和 SOX9 的表達(dá)，升高 COX-2 和 MMP13 的水平（圖 1D ）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)也一致顯示，異常 FSS 對原代軟骨細(xì)胞具有負(fù)向調(diào)控作用（圖 1E）。

圖 1 異常 FSS 對原代軟骨細(xì)胞的生物學(xué)影響

接著，由于組蛋白甲基化是基因表達(dá)中最重要的表觀遺傳調(diào)控方式之一，研究人員檢測了經(jīng) FSS 處理的軟骨細(xì)胞中主要的組蛋白甲基化修飾（H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3、H3K36me3和 H3K79me3）。結(jié)果顯示 ，FSS 處理后 H3K4me3 顯著過表達(dá)，而 H3K27me3 表達(dá)受抑制（圖 2A ），且免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí) FSS 會使軟骨細(xì)胞中 H3K4me3 顯著上調(diào)（圖 2B）。由于 H3K4me3 與基因激活密切相關(guān)，研究進(jìn)一步探究其激活機(jī)制，結(jié)果顯示 FSS 處理后組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 Kmt2b 的 mRNA 表達(dá)及 KMT2B 蛋白水平均明顯升高（圖 2C和圖 2D），表明FSS 可能通過上調(diào) KMT2B 來激活 H3K4me3。

圖2 FSS 導(dǎo)致 H3K4me3 激活和 KMT2B 上調(diào)。

由于H3K4me3 激活在 OA 中起重要作用，研究人員用 MM-102 抑制其活性進(jìn)行探究。實(shí)驗(yàn)先用 20μM MM-102 預(yù)處理細(xì)胞 24 小時(shí)，再用常用于模擬軟骨細(xì)胞凋亡的SNP（500μM）孵育，結(jié)果顯示 MM-102 預(yù)處理減輕了 SNP 對軟骨細(xì)胞的凋亡刺激（圖 3A）。更重要的是，MM-102 預(yù)處理有效逆轉(zhuǎn)了 FSS 對軟骨細(xì)胞的負(fù)面影響，這為基于表觀遺傳學(xué)的 OA 治療提供了基礎(chǔ)（圖 3B 和3C）。

圖3 通過 MM-102 藥理學(xué)抑制 H3K4me3 激活可部分逆轉(zhuǎn) FSS 對軟骨細(xì)胞的負(fù)面影響。

接下來，為了探究 FSS 誘導(dǎo) OA 的分子機(jī)制，研究人員先通過轉(zhuǎn)錄組分析確定 FSS 處理后 430 個(gè)上調(diào)基因，再經(jīng) CUT&Tag 測序發(fā)現(xiàn) 586 個(gè)受 H3K4me3 調(diào)控的基因，兩者交集篩選出 10 個(gè)基因（Capn12、Cldn1、Gpcpd1、Il13ra2、Mex3b、Nexn、Slc20a1、Srek1、Tgif1 和 Zbtb20）（圖 4A）。經(jīng) qPCR 驗(yàn)證，Zbtb20 是 FSS 處理后上調(diào)最顯著的基因（圖 4B），故被選為潛在的 H3K4me3 靶基因。CUT&Tag 驗(yàn)證顯示 Zbtb20 是 FSS 引起的 H3K4me3 激活的直接靶標(biāo)（圖 4D），且 FSS 處理后 ZBTB20 蛋白表達(dá)顯著升高（圖 4E），而 MM-102 預(yù)處理可逆轉(zhuǎn) FSS 導(dǎo)致的 ZBTB20 在 mRNA 和蛋白水平的升高（圖 4F 和 4G）。以上結(jié)果表明，ZBTB20 直接受 FSS 誘導(dǎo)的 H3K4me3 激活調(diào)控。

圖4 在暴露于 FSS 的軟骨細(xì)胞中確定 ZBTB20 為 H3K4me3 的靶基因。

為進(jìn)一步研究 ZBTB20 對軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用，研究人員通過腺病毒實(shí)現(xiàn) ZBTB20 過表達(dá)。qPCR 和 Western blot 結(jié)果驗(yàn)證了原代軟骨細(xì)胞中 ZBTB20 的過表達(dá)成功（圖 5A）。結(jié)果顯示其會誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡（圖 5B），抑制 Col2、Sox9 和 Acan 的 mRNA 表達(dá)（圖 5C），同時(shí)上調(diào) Col10、Cox-2 等肥大與分解代謝相關(guān)標(biāo)志物（圖 5C），以及 Mmp 家族和炎癥因子（圖 5C），表明 ZBTB20 對軟骨細(xì)胞有負(fù)面影響，會引發(fā)基質(zhì)降解和炎癥反應(yīng)。ZBTB20 過表達(dá)后，COLII 和 SOX9 的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而 COX-2 和 MMP13 的水平顯著升高（圖 5D）。鑒于 Wnt 信號通路與機(jī)械刺激響應(yīng)及關(guān)節(jié)疾病相關(guān)，且 KEGG 富集分析涉及該通路，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) ZBTB20 過表達(dá)可激活 Wnt 信號通路（β- 連環(huán)蛋白水平顯著上調(diào)）（圖 6A ）。而 Wnt/β- 連環(huán)蛋白抑制劑 LF3 處理能有效緩解 ZBTB20 的負(fù)面影響，減少細(xì)胞凋亡（圖 6B）。在過表達(dá) ZBTB20 且經(jīng) LF3 處理的軟骨細(xì)胞中，軟骨相關(guān)的正向標(biāo)志物 Sox9、Col2 和 Acan 的表達(dá)得到改善，而代表軟骨退化和炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物表達(dá)降低（圖 6C ）。Western blot 實(shí)驗(yàn)也得到了相同結(jié)果，表現(xiàn)為 LF3 處理的細(xì)胞中 COLII 和 SOX9 上調(diào)，COX-2 和 MMP13 下調(diào)（圖 6D ）。

圖5 ZBTB20 顯著影響原代軟骨細(xì)胞的生物學(xué)表型、軟骨退化及炎癥反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn) FSS 會激活 Wnt 信號通路（圖 6E），為明確該通路是否參與異常 FSS 誘導(dǎo)的軟骨發(fā)病，使用 Wnt/β- 連環(huán)蛋白抑制劑 LF3 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示 LF3 預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)SNP 引起的細(xì)胞凋亡（圖 6F），且能減輕 FSS 對原代軟骨細(xì)胞的破壞，使 COLII、SOX9 水平升高，COX-2、MMP13 水平降低（圖 6G和6H）。由此推測，FSS 通過 KMT2B-H3K4me3-ZBTB20 介導(dǎo)的 Wnt 信號通路激活來破壞軟骨。

圖6 Wnt 信號通路密切參與 ZBTB20 或 FSS 介導(dǎo)的軟骨發(fā)病機(jī)制。

研究人員通過 UAC 小鼠模型（模擬異常咬合誘導(dǎo)的 TMJOA）進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，結(jié)果顯示 UAC 組小鼠存在明顯的軟骨降解和退化：顯微 CT 顯示，與假手術(shù)對照組相比，UAC 組的骨密度（BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁數(shù)量（Tb.N）降低，而骨小梁分離度（Tb.Sp）增加（圖 7A）；UAC 組中 Col2 和 Sox9 的 mRNA 表達(dá)水平下調(diào)，Cox-2 和 Mmp13 的 mRNA 表達(dá)水平上調(diào)（圖 7B）；H&E 和番紅 O 染色顯示UAC 小鼠 的OARSI 評分升高和軟骨細(xì)胞密度降低 （圖 7C）；免疫組化顯示，UAC 組的 COLII、SOX9 蛋白減少，COX-2、MMP13 蛋白增加（圖 7D）。同時(shí)，UAC 小鼠顳下頜關(guān)節(jié)組織中 H3K4me3 和 ZBTB20 被強(qiáng)烈激活（陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多）（圖 7D）。在異常機(jī)械力誘導(dǎo)的 TMJOA 中，H3K4me3 和 ZBTB20 的表達(dá)失調(diào)， 表明H3K4me3-ZBTB20 軸可能在剪切應(yīng)力相關(guān)的顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)病中發(fā)揮調(diào)控作用。異常 FSS 誘導(dǎo) OA 的基于表觀遺傳學(xué)機(jī)制的整體工作模型如圖 8 所示。

圖7 體內(nèi)單側(cè)前牙反合小鼠模型驗(yàn)證。

圖8 異常 FSS 誘導(dǎo) OA 的基于表觀遺傳學(xué)機(jī)制的整體工作模型。

總之，研究揭示了高 FSS 相關(guān)軟骨發(fā)病中的新表觀遺傳修飾，明確 H3K4me3-ZBTB20 是關(guān)鍵介導(dǎo)因子，且抑制 H3K4me3 或 Wnt 信號可部分逆轉(zhuǎn) FSS 對軟骨細(xì)胞的破壞。該研究發(fā)現(xiàn) OA 發(fā)病中機(jī)械應(yīng)力與表觀遺傳事件的潛在關(guān)聯(lián)，為基于表觀遺傳學(xué)的關(guān)節(jié)疾病治療方法提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：Jin Y, Li Z, Wu Y, Li H, Liu Z, Liu L, Ouyang N, Zhou T, Fang B, Xia L. Aberrant Fluid Shear Stress Contributes to Articular Cartilage Pathogenesis via Epigenetic Regulation of ZBTB20 by H3K4me3. J Inflamm Res. 2021 Nov 19;14:6067-6083. doi: 10.2147/JIR.S339382. PMID: 34824542; PMCID: PMC8610757.

原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8610757/

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